二、核酸樣本準(zhǔn)備與轉(zhuǎn)膜：

Sourthen blotting一般來檢測基因組DNA中基因的變化，一般需要10ug基因組DNA，轉(zhuǎn)模推薦尼龍膜或正電荷尼龍膜。轉(zhuǎn)膜后探針將共價結(jié)合DNA。轉(zhuǎn)膜時間 5-18小時，從5毫米厚的0.7％瓊脂糖凝膠中獲得15 kb分子的可接受轉(zhuǎn)移; 如果片段是1kb大小，2小時即可。

三、探針的獲得：

Sourthern探針可以用PCR標(biāo)記，隨機引物標(biāo)記方法，T7/SP6轉(zhuǎn)錄的特異性RNA探針。末端轉(zhuǎn)移酶在寡核苷酸的3'末端添加一個DIG-11-ddUTP.DIG寡核苷酸5'-末端標(biāo)記：通過缺口翻譯進行DIG標(biāo)記，或cDNA合成，外顯子生物均可提供上述探針標(biāo)記。價格約2000元，至少滿足20次。使用的探針濃度約10-15ng/ml，探針長度變化，導(dǎo)致使用質(zhì)量很大，原因在于分子量不同。

四、結(jié)果顯色說明：

可以采用堿性磷酸酶底物CSPD，底物NBT和BCIP，抗-地高辛過氧化物酶，抗地高辛FITC和抗地高辛-羅丹明。上述均可用于X底片顯色。

五、實驗操作步驟：

（1）凝膠電泳：使用合適的限制酶酶切DNA，保持獲得15kb-0.5kb左右片段。準(zhǔn)備適當(dāng)百分比的瓊脂糖凝膠。在凝膠上跑膠。如果需要，可用溴化乙錠對凝膠進行染色，以觀察DNA片段是否轉(zhuǎn)移到膜上。

（2）在室溫下?lián)u動將凝膠浸入脫嘌呤液體中8-10分鐘，使得核酸容易雜交。

（3）進行變性之前，用H₂O沖洗凝膠2次。

（4）變性，中和和印跡

在室溫下將凝膠浸入變性溶液中2 x 15分鐘。輕輕搖動。用H2O沖洗凝膠。將凝膠浸入中和溶液中2 x 15分鐘。用鑷子在邊緣檢查它的pH值應(yīng)低于9，否則膜將在雜交過程中變黃并破裂。

（5）轉(zhuǎn)模：按照下圖制作轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，利用試劑盒提供的轉(zhuǎn)膜液通過毛細管轉(zhuǎn)移到膜上，從凝膠吸取DNA到尼龍膜過夜，以確保DNA有效轉(zhuǎn)移。  

      轉(zhuǎn)模圖（略）

（6）轉(zhuǎn)模后，固定膜上的核酸，使用 UV交聯(lián)濕膜，無需清洗。UV交聯(lián)后，用H₂O短暫沖洗膜，然后使其風(fēng)干�；蛟�120°C下烘烤，30分鐘

（7）預(yù)雜交和雜交：推薦探針濃度：10–20ng/ml，DIG標(biāo)記探針：20–50 ng / ml 將印跡膜放在包含20 ml預(yù)雜交溶液的雜交袋中，密封袋子，預(yù)雜交溫度下預(yù)雜交2小時。雙鏈DNA探針，在沸水浴中加熱10分鐘使DNA變性，在冰上冷卻。單鏈RNA探針和寡核苷酸探針在稀釋前不需變性。準(zhǔn)備至少3.5 ml雜交溶液，以滿足10x10 cm的印跡。在雜交溶液中稀釋探針。丟棄袋子內(nèi)預(yù)雜交溶液，添加包含DIG標(biāo)記探針的雜交溶液。42℃條件下雜交15-18小時，最好搖動雜交。

（8）洗滌：在室溫下，將膜在洗滌液I中洗滌兩次，每次5分鐘，除去未結(jié)合的探針。在洗滌液II中清洗膜兩次，每次清洗15分鐘。>100bp探針應(yīng)在68°C下洗滌。對于較短的探針，降低清洗溫度。注意：對于大多數(shù)應(yīng)用在洗滌液II足夠嚴(yán)格。憑經(jīng)驗確定是否有必要用洗滌溶液III，如果需要增加洗滌一次。

（9）雜交后洗滌，將膜在洗滌液I中平衡1分鐘。在封閉溶液中輕輕攪動薄膜30-60分鐘，封閉薄膜。

（10）二抗孵育：稀釋抗高辛抗體，將3 µl Anti-Digoxigenin-AP添加到30 ml封閉液中并混合。與CDP-Star一起使用時，在封閉溶液中稀釋Anti-Digoxigenin-AP 1：20,000。該工作抗體溶液在4°C下穩(wěn)定約12小時。倒出封閉溶液，于制備的抗體溶液中將膜孵育30分鐘。棄抗體溶液，在洗滌液I中輕輕洗膜兩次，每次洗滌15分鐘。

（10）曝光檢測信號：棄洗滌液，在檢測緩沖液中平衡膜2分鐘。在化學(xué)發(fā)光前保持濕潤。利用化學(xué)發(fā)光檢測 可以將光信號記錄在X膠片上。CDP-Star通常只需要15–60s的曝光時間，而CSPD的曝光時間通常是15–30分鐘。NBT/BCIP一般120s內(nèi)。

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