(1)收集:染色體以 50g離心力 離心 3 分鐘,將含有染色體的上清液轉(zhuǎn)移到干凈離心管中。再次將染色體懸浮液以 50g離心力 再離心 3 分鐘,上清液移入新的離心管中,主要除去染色體提取物中存在的大部分細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。
(2)純化染色體:將懸浮液利用針頭吸入 3或5ml注射器。然后穿過無菌尼龍網(wǎng),分離和提取的染色體(外顯子生物,貨號(hào):001.503),用 DNA 結(jié)合染料(如 DAPI)來確定,熒光下觀察以確定該等分試樣中的染色體數(shù)量。
(3)將上述尼龍網(wǎng)用0.9%氯化鈉溶解,制成106 條染色體/ml 樣品的染色體懸浮液,在1 ml 的緩沖液中稀釋,并通過加入 20 滴 3:1 甲醇:乙酸固定液,輕輕旋轉(zhuǎn)懸浮液進(jìn)行固定。然后將染色體以 350g 離心 10 分鐘,去除上清液。將 1 ml 體積的相同固定劑添加到輕彈的沉淀中,在室溫下孵育 30 分鐘。在相同條件下離心后,除去上清液,加入1ml新鮮固定液。
(4)離心去除上清液后,將染色體沉淀重懸于 160 μl 預(yù)熱的雜交緩沖液(40% 去離子甲酰胺、4×SSC、2×Denhardt 溶液,外顯子生物,001.504)中。將體積為 2.5 μl 的用所需要的生物素染色體探針78℃預(yù)熱5分鐘, 添加到染色體懸浮液中,將整個(gè)混合物在 73°C 下變性 3.5 分鐘。然后將其在冰上保持 5 分鐘,在 37°C 振蕩中孵育 2 0 小時(shí)左右。
(5)離心和重懸,在 500 μl 預(yù)熱的 0.1×SSC 中獲得標(biāo)記的染色體。將染色體離心并將沉淀物重新懸浮在 2×SSC 中。將 15 μl 的等分試樣用 DAPI 染色以確保染色體存在。
(6)將親和素磁珠與 1×106 探針結(jié)合的染色體懸浮在 100 μl 緩沖液中,該緩沖液含有 0.05% (v/v) 吐溫 20 和 5% (v/v) 脫脂干牛奶。懸浮液在 37°C 振蕩水浴中孵育 2 小時(shí)。然后將懸浮液轉(zhuǎn)移到方形比色皿中,通過將比色皿的一側(cè)暴露于條形磁鐵來收集珠結(jié)合部分。通過將等體積的樣品和預(yù)熱的 2.0 M 羥胺·HCl 溶液(pH 8.5)在 37°C 下攪拌 4 小時(shí)來切割珠子。
(7)裂解的磁珠可以通過暴露在磁場(chǎng)中來收集。也可以通過以 350g 離心樣品并吸出上清液收集含有染色體的離心沉淀來去除過量的成份。
(8)將分離的染色展在顯微載玻片上,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。