【產(chǎn)品名稱】
多色免疫熒光顯色試劑盒
【產(chǎn)品貨號(hào)】
CB0023
【產(chǎn)品規(guī)格】
100人份
【儲(chǔ)存條件】
2-8℃儲(chǔ)存，密封避光
【生產(chǎn)日期】
見(jiàn)外包裝
【有效期】
有效期12個(gè)月
【用途】
用于石蠟組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞的多靶點(diǎn)免疫熒光染色
【染色原理】
E-TSA多靶點(diǎn)免疫組化染色試劑盒采用酪胺信號(hào)放大技術(shù)（TSA,Tyramide Signal Amplification），利用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）介導(dǎo)的酶促反應(yīng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行多位點(diǎn)原位標(biāo)記，大幅提高檢測(cè)的靈敏度和信噪比。TSA標(biāo)記是共價(jià)鍵結(jié)合，非常穩(wěn)定，在抗體洗脫時(shí)抗體復(fù)合物被去除而TSA染料的結(jié)合不受影響，從而解除了抗體種屬對(duì)染色的限制。因此可以使用同一種屬來(lái)源的一抗進(jìn)行多靶點(diǎn)標(biāo)記。通過(guò)采用不同熒光標(biāo)記的TSA染料實(shí)現(xiàn)對(duì)組織樣本的多靶點(diǎn)染色。
【檢測(cè)樣本】
1. 不同物種的活檢或手術(shù)切除樣本；石蠟組織切片，冰凍組織切片，混合培養(yǎng)細(xì)胞。
2. 組織離體后使用10%中性福爾馬林固定，固定時(shí)間8-48 h最佳；
3. 建議組織切片厚度3-6μm，使用防脫載玻片。
【所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備及耗材】
實(shí)驗(yàn)設(shè)備：
離心機(jī),漩渦混勻器,恒溫孵育雜交儀
實(shí)驗(yàn)耗材：
晾片板、防脫載玻片、蓋玻片、量筒、移液器、EP管、移液器吸頭
【其它實(shí)驗(yàn)試劑】
滅菌去離子水,PBS,
【熒光染料光譜及包裝信息】
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貨號(hào) |
熒光染料 |
激發(fā)波長(zhǎng)（nm） |
發(fā)射波長(zhǎng)（nm） |
儲(chǔ)存狀態(tài) |
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CB0023-DAPI |
DAPI-Antifade Solution |
353 |
442 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-01 |
TSA-DEAC |
426 |
450 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-02 |
TSA-A488 |
493 |
517 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-03 |
TSA-Cy3 |
550 |
570 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-04 |
TSA-Cy3.5 |
581 |
596 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-05 |
TSA-Cy5 |
649 |
670 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-06 |
TSA-Cy5.5 |
675 |
694 |
-20℃，溶液 |
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【其它試劑包裝信息】
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貨號(hào) |
試劑名稱 |
儲(chǔ)存狀態(tài) |
試劑顏色 |
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CB0023-B1 |
Hybridization Buffer |
4℃，溶液 |
無(wú)色透明 |
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CB0063-B2 |
TSA稀釋液 |
4℃，溶液 |
無(wú)色透明 |
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CB0023-B3 |
抗體稀釋液/封閉液 |
4℃，溶液 |
淡黃色透明 |
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CB0023-B4 |
Anti-Dig-HRP或avidin-HRP |
4℃，溶液 |
無(wú)色透明 |
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CB0023-B5 |
Washing BufferⅠ（10X） |
4℃，溶液 |
無(wú)色透明 |
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CB0023-B6 |
SolutionA |
4℃，溶液 |
無(wú)色透明 |
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CB0023-B7 |
SolutionB |
4℃，溶液 |
無(wú)色透明 |
【工作液配制】
用抗體稀釋液/封閉液將酶標(biāo)Anti-Dig-HRP或avidin-HRP濃縮液按照1：100稀釋配置為二抗工作液（使用前半小時(shí)內(nèi)配置，請(qǐng)勿提前配置）
DAPI工作液
即用
*建議每張切片單次加液為工作液50-100 μl
【實(shí)驗(yàn)操作】
注意：開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備、耗材、其它試劑等均已準(zhǔn)備完畢，仔細(xì)閱讀【工作液配制】部分并按照要求配制工作液。不同組織切片可能有所差別,具體實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。
1. 玻片預(yù)處理
烤片和脫蠟水化流程抗原修復(fù)
1.1 取玻片放在原位雜交儀的烤片臺(tái)上90℃烤片 30分鐘
1.2 取出玻片，放于二甲苯中室溫侵泡兩次每次10分鐘
1.3 取出玻片，于梯度乙醇(無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇)中室溫侵泡各5分鐘
1.4 取出玻片，于PBS中3分鐘
1.5 取出玻片，3%H2O2侵泡10分鐘，于PBS中2分鐘
1.6 EDTA(pH9.0)20分鐘，100℃煮片（如果組織切片比較容易掉片可以用98℃水浴），于PBS中2分鐘
（如果是冰凍組織切片1.1取切片，室溫放置20分鐘，PBS泡5分鐘，1%多聚甲醛侵泡10分鐘1.2 PBS洗2次每次5分鐘 1.3滴加SolutionB室溫處理10分鐘，PBS洗2次每次5分鐘）
1.7 胃蛋白酶處理液37℃孵育15分鐘，于PBS中侵泡2次每次5分鐘
1.8 95%乙醇侵泡2次每次2分鐘，晾干
2. 封閉
2.1 Hybridization Buffer 100 μl，15分鐘，室溫封閉
3. 原位雜交探針（可以1-5種）同時(shí)孵育
3.1 特異性探針（Dig或生物素標(biāo)記探針）：Hybridization Buffer =1：50配成工作液（可多個(gè)不同標(biāo)記的探針同時(shí)孵育），每張片子滴加50-100μl封閉2小時(shí)，40℃
3.2 Washing BufferⅠ（1X）洗 3次每次5分鐘
4. 抗體稀釋液/封閉液室溫下封閉30分鐘
5. HRP二抗孵育
5.1 滴加HRP二抗（地高辛或生物素）工作液50-100μl，1小時(shí)，37℃
5.2 Washing BufferⅠ（1X）洗 3次每次5分鐘
6. TSA顯色
6.1 TSA染料工作液50-100μl，8-15分鐘，室溫避光
6.2 Washing BufferⅠ（1X）洗 3次每次5分鐘
7. 滴加SolutionA室溫處理10分鐘，PBS洗2次每次3分鐘
*重復(fù)步驟3-7，直至完成最后一輪染色;若只有一次TSA顯色，直接進(jìn)行步驟8，無(wú)需步驟7
8. 滴加DAPI染液蓋玻片封片，室溫避光20分鐘
*實(shí)驗(yàn)步驟中所有條件均為建議條件，具體實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。
【產(chǎn)品性能描述】
染色完成后使用全景熒光掃描儀進(jìn)行圖像采集和分析，圖像采集參數(shù)為曝光強(qiáng)度100%；曝光時(shí)間5ms；信號(hào)表達(dá)在細(xì)胞膜上，且信號(hào)背景干凈。
【注意事項(xiàng)】
1. pH值對(duì)染色有影響，載玻片應(yīng)清潔、無(wú)酸堿污染，否則影響染色效果；
組織染色后及時(shí)成像，如需儲(chǔ)存請(qǐng)-20℃避光。
以下是代表性結(jié)果，雙色原位雜交,2個(gè)mRNA共定位。
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