動物胚胎原位雜交實驗步驟

一、本原位雜交實驗步驟適合：

(1)非洲爪蟾，線蟲，小鼠胚胎，小昆蟲、果蠅等

(2)應(yīng)用范圍：

整體原位雜交，胚胎原位雜交，RNA探針，DNA探針，NBT/BCIP，二抗顯色；

(3)需要的耗材：透明可立玻璃瓶2.5mL或24孔板（外顯子生物科供），1.5ml離心管，10ml離心管，15ml離心管，槍頭，封口膜，FISH封片膠、FISH鉆石筆（外顯子生物可供）。

（4）需要的設(shè)備：烤箱，原位雜交儀（外顯子生物，型號：E308（3200元）；型號：EB405，2.5萬）；雙孔水浴鍋；濕盒孵育儀。

二、動物胚胎固定

1.取材： 按照正常胚胎取材，如冰箱冷凍的標本，則需要固定前使用2.5％半胱氨酸（pH 8.0）（具體貨號請見參考目錄）對胚胎進行去凍。使用細鑷子在固定之前移除胚胎包膜。具體方法：用玻璃巴斯德管或剪去一部分的槍頭轉(zhuǎn)移胚胎，用酒精燈的火焰熔化鋒利的邊緣，以減輕傷害胚胎，以便拾取胚胎。

注意：（1）使玻璃移液管注意溫度，避免灼傷胚胎；（2）標本過老或放置過久，會出現(xiàn)背景；（3）標本過大，可用針穿刺，使得探針或染料充分進入；（4） 可以將標本放入無水乙醇，標本變硬，切成兩份。

2. 標本固定：

（1）準備上述雜交瓶或24孔板，用于胚胎固定。 這些樣品瓶可用最終標本的儲存。透明小瓶最好，可觀察胚胎。 使用鉆石筆或油性Maker標記筆標記小瓶，用透明膠帶覆蓋標簽，接觸的醇和其他溶劑會導(dǎo)致標記物筆跡的消失。

（2） 配制或購買：用Mempfa修復(fù)固定胚胎（具體貨號和配方見后面參考目錄）；4％多聚甲醛配制（具體貨號請見參考目錄）。

（3）配置Mempfa固定溶液， 確保多聚甲醛的最終工作濃度為4％。 將其他溶液的所有組分儲存在2-8℃。用移液管或槍頭將胚胎添加到已填充有約3-4mL Mempfa溶液的璃瓶中來固定胚胎。 每個小瓶固放置胚胎數(shù)量根據(jù)大小調(diào)整。 Mempfa溶液中的胚胎在室溫下固定2小時或在4℃下固定過夜。

注意事項：1）對于晚期內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)，在分離的腸和內(nèi)胚層衍生物上進行固定，便于探針的穿透且避免腔染色。2）在-20℃下儲存100％甲醇溶液。多聚甲醛固定后, 用約4毫升-20℃,100％甲醇替換Mempfa溶液，用于儲存胚胎。3）加入甲醇后旋轉(zhuǎn)小瓶以防止胚胎粘在玻璃或其他胚胎上。 另外，確保小瓶密封，甲醇會隨著時間的推移在冷凍室中蒸發(fā)。4）胚胎可以在染色前在甲醇中儲存至少一年，不影響原位雜交結(jié)果。

（4）具體步驟：

1. 水化胚胎：75%, 50%, 25% 甲醇/PBS-T，可以在合適的離心管。洗滌一次PBS-T。以上每步均是5分鐘。

2. 蛋白消化： 10 μg/mL 蛋白酶K/ PBS-T （目錄中的蛋白酶K是20mg/ml）

1）胚齡胎齡 6.5-7.5 d的消化5分鐘； 8.5天的消化 10 min；9.5天的消化15 min. 10.5天的消化 20 min. 2）其他組織：可以用0.5 μg/mL的蛋白酶K處理 5 min。3）組織的厚度和硬度適當調(diào)整消化程度。4）薄的組織和疏松組織，可以不用蛋白酶K消化。

3．停止消化：

在 4% paraformaldehyde/0.1% glutaraldehyde 溶液浸泡20分鐘。

4.失活蛋白酶K：加入適量的2 mg/mL glycine/PBS-T（參見目錄）。

5．洗滌洗滌胚胎：

在PBS-T中一次，5分鐘。 再用1:1 的PBST/雜交液（貨號參見目錄）洗滌一次。

6. 徹底洗滌： 利用胚胎雜交液再次洗滌一次。

7. 放入新的 雜交液, 孵育1-24 h，溫度 65°C-70°C。如果停止實驗，此步驟可以放置-20°C存放。

8. 探針雜交：探針濃度0.1-1 μg/mL的DIG-labeled RNA probe或其他探針（外顯子生物），雜交 65-70℃. 12-48，搖動孵育。

二、探針的制備

1.使用1-2μg模板RNA制備地高辛（Dig）標記的探針或其他探針。 制備：用含有目的基因的載體，限制酶切割，含T3或 T7或U6啟動子酶反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義探針和正義探針。也可以從外顯子生物購買探針直接解決問題。

2.探針合成制備的反應(yīng)，探針標記溫度37℃條件下時間不超過2小時。反應(yīng)具體內(nèi)容請參考相關(guān)資料或咨詢我們。最后在高鹽和冷凍條件下沉淀RNA探針。

3. 孵育2小時后，在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入1μL DNAseI（RNAse free grade），在37℃再孵育10分鐘，以消除DNA。

4.制作瓊脂糖凝膠，測試探針的濃度和純度。

（1） 取出1μL反應(yīng)混合物，檢查1％瓊脂糖-TAE凝膠，剩下的（19μl）加入80μl含1％ SDS的TE緩沖液（10mM Tris pH8.0,1mM EDTA）， 10μl 5M 醋酸和220μl冷乙醇。 劇烈渦旋混合物并置于冰上，待RNA質(zhì)量檢查結(jié)果出來，決定下一步。

（2）在1％瓊脂糖-TAE凝膠上沉淀之前，吸取1μlRNA。向RNA中加入4-5μl水和1μl標準上樣染料。 使用UV光透射儀在凝膠上觀察RNA，檢查探針質(zhì)量。

（3） 如果質(zhì)量可以，微量離心機中高速離心探針，15分鐘，沉淀留在冰上的剩余RNA，吸出上清液，讓其短暫干燥。

（4）1mL RNA雜交緩沖液，重懸探針。 渦旋并將管短暫加熱至37℃，離心， 將探針轉(zhuǎn)移到15ml螺旋蓋管中，用RNA雜交緩沖液填充至7-10ml。

注意：探針可以進一步稀釋（稀釋10倍仍然可以）通常導(dǎo)致背景低，但染色反應(yīng)也需要更長時間。

三、原位雜交

1. 取出儲存在-20℃甲醇中的胚胎，至室溫。

（1）水化胚胎： 將胚胎再水化，準備添加探針。 每次更換液體，旋轉(zhuǎn)胚胎以確保它們不會粘附， 轉(zhuǎn)移液體時，檢查蓋子內(nèi)部以確保胚胎沒有被粘附。

（2）將雜交液體加入瓶內(nèi)含探針），65℃預(yù)熱RNA雜交緩沖液和探針，胚胎雜交過夜。

2.倒出探針溶液，將使用過的探針，放在15ml試管中，標記日期和使用次數(shù)，存于-20℃，可以反復(fù)利用。

3.雜交后洗滌，用預(yù)熱的雜交液洗滌兩次，溫度：65-70℃，更換液體即可。更換新的離心管，將封閉液體倒入其中，放入胚胎。5min后，再更換一次。用1:1 hybridization mix/MABT孵育5min。

4.用MABT孵育15 min。室溫MABT/2% blocking 孵育1-2小時；在4℃，孵育二抗過夜，或室溫至少4小時，抗體1：2000稀釋，MAB + HTSS + BR +抗Dig抗體。

5. 二抗體孵育過夜：去抗體洗滌，將胚胎轉(zhuǎn)移到MABT溶液，1.5小時更換溶液，3-5次。MABT溶液浸泡胚胎過夜，低溫最好。進行至少12次30分鐘的洗滌 ，減少背景。使用TBT溶液進行洗滌步驟。

6. 用堿性磷酸酶底物溶液替換洗滌溶液（一定用堿性溶液，參見目錄）。AP顯色，37℃條件下進行。也可4-8℃條件下，顯色 1-4 天。直到背景出現(xiàn)。當顏色合適的時候，利用PBS-T洗滌至少兩次，5分鐘每次，然后 4% PFA/0.1% glutaraldehyde/PBS-T 固定2小時室溫。標本可以放置：4°C，PBS-T包含 0.1% 疊氮鈉的溶液中（參見目錄貨號）。

注意：在37℃下染色更快，如果放置過夜，會導(dǎo)致不可接受的背景染色。染色反應(yīng)通常需要過夜染色，室溫對此最安全。

顯色注意事項：1）BM紫色溶液呈藍色，則用新鮮的BM Purple替換染色溶液并將管放37℃。如果靶mRNA非常豐富，將胚胎置于4℃的染色溶液中過夜，然后將胚胎移至室溫或37℃，以更好地檢測染色反應(yīng)。2）不同靶RNA之間的最終結(jié)果時間差異很大。為保持一致性，當孵育時間較長時沒有新的變化時，停止染色反應(yīng)。重要的是，對照胚胎之間用相同的時間進行顏色反應(yīng)。3） 通過FISH顯色終止液停止染色，準備胚胎儲存和拍照，不要在此階段搖動胚胎。注意：胚胎通常是淡藍色陽性信號，冷甲醇可以少部分地除去染色溶液，不能去除重的背景或腔染色。冷甲醇是指保存在-20℃冰箱中的甲醇。4）將胚胎再水化并用Mempfa固定。固定后，取出Mempfa并用25％甲醇洗滌胚胎。5）去除內(nèi)源性色素，則除去25％甲醇并加入內(nèi)源性酶AP去除溶液（參見目錄）。仔細觀察漂白可以根據(jù)不同的效果而變化。6）將胚胎通過甲醇系列脫水至100％甲醇，轉(zhuǎn)移至PBS進行短期和拍照。

四、胚胎成像

（1）胚胎染色后，對胚胎進行成像處理，獲得目的基因的表達，可以使用1％瓊脂糖作為背景來觀察。注意：瓊脂糖呈現(xiàn)灰色背景，與胚胎和染色反應(yīng)的藍色形成鮮明對比。

（2）將瓊脂糖加入水中，然后煮沸直至瓊脂糖溶解，然后冷卻至50℃，然后倒入培養(yǎng)皿中。與TAE凝膠溶液一樣，將瓊脂糖溶液儲存在55℃的培養(yǎng)箱中可多次使用。

（3）將甲醇儲存標本再水化成水溶液（PBS），將胚胎放入培養(yǎng)皿中加入瓊脂糖。保持溶液清潔，如果需要，簡單的濾網(wǎng)過濾消除小顆粒，解決圖像清晰背景的問題。

（4）為了從其他的角度（如腹側(cè)）對胚胎進行拍照，在瓊脂糖中切出薄的通道，使用細鑷子將胚胎放入胚胎中并將胚胎置于這些通道中進行定向。 小心操縱胚胎，它們?nèi)菀资軗p。

注意：每個階段有獨特的位置，放入溶液時會有特征位置。例如，囊胚期胚胎傾向于把動物放在一邊。一旦胚胎開始伸長，它們就會側(cè)臥（外顯子生物提供提示體式顯微鏡拍照服務(wù)）。

2. 使用體式顯微鏡角度照射胚胎，胚胎上形成陰影，為圖像提供深度并幫助識別表面結(jié)構(gòu)。

3. 將胚胎背景清除，以便對胚胎深處進行染色成像。例如脊索，肺或大腦區(qū)域。為此，將胚胎通過甲醇系列直至100％甲醇。（1）完全浸入甲醇后，將胚胎轉(zhuǎn)移至一份苯甲醇和兩份苯甲酸芐酯（BABB）的溶液中。胚胎最初漂浮在表面上，但當甲醇與BABB混合時，它們會沉入BABB。在玻璃瓶中處理BABB的每一步; BABB會熔化任何塑料或油漆。（2）清除后，用來自胚胎下方的透射光觀察胚胎。調(diào)整光線強度以及從下方開始的角度，以提高對比度和最佳色彩。（3）當觀察清除的胚胎時，將玻璃培養(yǎng)皿從基部上抬起。通過簡單地使用另外兩個培養(yǎng)皿蓋來提升它，以便使具有胚胎的培養(yǎng)皿區(qū)域升高（外顯子生物提供提示體式顯微鏡拍照服務(wù)）。注意：這樣做的好處是消除顯微鏡底座上可能干擾圖像的瑕疵或污漬的干擾。

胚胎常見溶液的配制：

（1）4%多聚甲醛；Paraformaldehyde（外顯子生物）

水浴鍋加熱至50-60℃，溶解多聚甲醛。加入1-3滴10N NaOH或直至pH約為7.5（pH試紙即可）。 多聚甲醛毒性很大，因此在通風(fēng)櫥中產(chǎn)生原液。 一旦多聚甲醛處于溶液中，將溶液通過Whatman紙過濾到新鮮容器中，加H₂O補齊最終體積。一般多聚甲醛溶液在4℃下保存1-2周。

（2）PBS-T (PBS with 0.5% Tween 20) （外顯子生物有售，粉末或溶液）；

（3）Methanol (25%, 50%, and 75%) in PBS-T（外顯子生物有售）：

（4）10% 原位雜交胚胎專用封閉液（外顯子生物，pH7.5）；

（3）固定液Glutaraldehyde (25%), 室溫（外顯子生物）；

表1 胚胎溶液目錄配方

備注：外顯子公司提供各種基因的原位雜交探針、原位雜交相關(guān)試劑和儀器耗材。

表2  相關(guān)溶液的使用說明

名稱	大概劑量		持續(xù)時間	溫度
100%甲醇	2ml		5min 搖勻	室溫
75%	2ml		5min 搖勻
50%	2ml		5min 搖勻
25%	2ml		5min 搖勻
TTw	2ml		10min搖勻
TTw	2ml		10min搖勻
TTw	2ml		10min搖勻
TTw		4ml	5 min搖勻
TTw		4ml	5 min搖勻
RNA雜交緩沖液		2ml	10min搖勻
預(yù)RNA雜交緩沖液		2ml	1h搖勻	65℃
探針		1ml	過夜，搖勻	65℃

表3.AP Buffer（新鮮配制或從冰箱小包裝解封 (NTMT)

Reagent	Amount to add	Final concentration
5 M NaCl	4 mL	100 mM
1 M Tris-Cl (pH 9.5)	20 mL	100 mM
1 M MgCl2	10 mL	50 mM
Tween 20	2 mL	1%
H2O	to 200 mL

備注：NTMT溶液  規(guī)格：100ml   價格:75.00元,無菌， 貨號：PF0125

表4.胚胎雜交Hybridization Buffer

試劑	終濃度
SSC	1.3X
EDTA (pH 8.0)	5 mM
Formamide	50% (v/v)
CHAPS	0.5% (w/v)
Heparin	100 μg/mL
Tween 20	0.2%
Yeast RNA	50 μg/mL
The hybridization mix can be stored at −20°C

備注：胚胎FISH雜交液液  規(guī)格：100ml  貨號：PF0130 價格:275.00元,無菌。

表5.MABT溶液

試劑	終濃度
Maleic acid (pH 7.5)	100 mM
NaCl	150 mM
Tween 20	0.1% (v/v)

備注：MABT溶液 貨號：PF0040，規(guī)格： 100ml  價格75元。

 

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