EB病毒原位雜交檢測試劑盒
一、試劑盒介紹：貨號：EB-1803
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試劑1 |
玻片處理液A |
50毫升 |
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試劑2 |
生物素標(biāo)記的EB探針雜交液 |
5毫升 |
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試劑3 |
HRP標(biāo)記的抗生物素抗體溶液 |
5毫升 |
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試劑4A |
DAB顯色液A液 |
0.5毫升 |
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試劑4B |
DAB顯色液B液 |
0.5毫升 |
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試劑5 |
蛋白酶K緩沖液 |
50毫升 |
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試劑6 |
PBS緩沖液 |
1000毫升×2袋 |
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試劑7 |
2xSSC緩沖液 |
1000毫升×4袋 |
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試劑8 |
蘇木素染液 |
50毫升 |
（1）檢測原理：
EB病毒屬DNA類的皰疹科病毒，能特異性嗜淋巴細(xì)胞。通過接觸傳播，將侵入鼻咽部的淋巴樣組織或其他腫瘤組織內(nèi)部。主要侵犯的是B淋巴細(xì)胞。EB病毒在自然界廣泛存在，與鼻咽癌發(fā)病密切相關(guān)、還腸道腫瘤以及傳染性單核細(xì)胞增多癥有關(guān)，此外還和淋巴瘤發(fā)病密切相關(guān)，如霍奇金淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤等、慢性疲勞綜合征、器官移植等。
EBER是EB病毒編碼的小RNA，在EB病毒感染的細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)。對EBER進行克隆、合成標(biāo)記的EBER RNA探針，可用于冰凍切片、石蠟切片、細(xì)胞涂片、細(xì)胞爬片，具有較高的特異性和靈敏度。
（2）試劑盒特點：
本試劑盒采用生物素標(biāo)記探針，辣根過氧化物酶系統(tǒng)DAB顯色劑，敏感性強；蛋白酶K消化，穩(wěn)定可靠；37℃雜交即可；常溫PBS洗滌；一步檢測。
（3）試劑盒成份：
（4）保存條件
Ø 所有試劑2-6℃保存;
Ø 試劑盒在有效期內(nèi)的穩(wěn)定;
Ø 不要使用已經(jīng)過期的試劑;
Ø 用前，將所有的試劑恢復(fù)至室溫（20-25℃），探針溶液必須混勻;
Ø 應(yīng)帶手套操作，使用新鮮二甲苯及乙醇溶液。
二、 檢測預(yù)準(zhǔn)備
l DAB顯色液：將試劑4A：4B：PBS按體積比1:1:18的比例混合，按實際需要量配制，即配即用。
l PBS配制：將一袋PBS粉末溶于1000毫升雙蒸水，徹底溶解，混勻后使用。
l SSC緩沖液：將一袋SSC粉末溶于1000毫升雙蒸水，溶解，混勻后使用。
三、 檢測步驟
1． 烤片：將組織切片置于烤箱或加熱板，在85℃的溫度下加熱20分鐘。.
2． 脫蠟：把加熱后的組織切片浸泡在二甲苯溶液中，五分鐘一次，總計三次。再將組織切片依次放入梯度乙醇100%、85%和75%中，每次3分鐘。用蒸餾水洗滌2分鐘。
3． 再用，3%的雙氧水浸泡組織切片15-25分鐘，用蒸餾水洗滌2分鐘。
4． 在組織切片或細(xì)胞上滴加200-300μl 玻片處理液，在常溫下浸泡20分鐘，用PBS洗滌5分鐘。
5． 每一個載玻片上滴加200-300μl 蛋白酶K緩沖液，使之覆蓋細(xì)胞，放入濕盒中，在37℃的干燥箱中培養(yǎng)15分鐘，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。
6． 每一個組織切片上滴加30-50μl的含有生物素標(biāo)記的EB探針的雜交液，蓋上蓋玻片，在95℃的加熱板上加熱5min，再放入濕盒中，在37℃的干燥箱中放置至少16h。
7． 取出濕盒中的組織切片，用2xSSC溶液洗滌15 min。
8． 在組織切片中加入30-50μl/片的HRP標(biāo)記的抗生物素抗體的溶液，常溫下孵育1小時，用2xSSC洗滌15分鐘。
9． 加適量配制好的DAB顯色液，顯色5-15分鐘，注意光鏡下觀察顯色情況。用蒸餾水沖洗1分鐘。
10． 滴加適量蘇木素復(fù)染，染色約1min，用蒸餾水或去離子水短時間沖洗，浸泡PBS 10分鐘返藍。
11． 封片：依次放入梯度乙醇溶液（75%、85%、100%）中各3min，再放入二甲苯溶液中，10分鐘。滴加中性樹脂，蓋蓋玻片，常溫保存。兩年內(nèi)不褪色。
四、 結(jié)果評判：
（1）陽性結(jié)果出現(xiàn)在細(xì)胞核上，顏色顯示深棕色或淺棕色，與EB含量有關(guān)，陰性結(jié)果是核上無棕色。
（2）細(xì)胞漿，紅細(xì)胞染色是非特異的，因為部分血液細(xì)胞、紅細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞存在內(nèi)源性酶或生物素。
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